錯(cuò)失諾獎(jiǎng)，只因太聽(tīng)大牛的話丨病毒超話

守法而弗變則悖。 ——《呂氏春秋》

(相關(guān)資料圖)

撰文 | 江艷君、李慶超（山東師范大學(xué)）

圖1. 17世紀(jì)中葉Hans Bollongier的郁金香靜物。帶有條紋的郁金香名為“永恒的奧古斯都”（Semper Augustus）。Hans Gillisz. Bollongier, Flower Piece, Rijksmuseum, 1639. | 來(lái)源：wikipedia

在17世紀(jì)人類歷史上的首次經(jīng)濟(jì)泡沫中，帶條紋的郁金香是投資者追捧的對(duì)象，當(dāng)時(shí)，一枚類似上圖的郁金香球莖動(dòng)輒數(shù)千荷蘭盾，價(jià)格相當(dāng)于一個(gè)工人十多年的收入，這就是所謂的“郁金香狂熱”（Tulip mania）。現(xiàn)在我們知道，這種珍稀的條紋是由“郁金香碎色病毒”（Tulip breaking virus，TBV）感染造成的。

實(shí)際上，人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)病毒就是一種感染植物的病毒，名為煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV，直譯過(guò)來(lái)是“煙草馬賽克病毒”）。它是人類探索微生物過(guò)程中的一座里程碑。

一

不知所蹤

1879年，德國(guó)植物病原學(xué)家Adolf Mayer開(kāi)始研究一種煙草疾病。這種病能讓煙草葉片呈現(xiàn)出深綠色和淺綠色的不規(guī)則圖案，還會(huì)枯萎、起皺，進(jìn)而導(dǎo)致煙草減產(chǎn)。根據(jù)患病煙草的損傷特征， Mayer把這種病稱為“煙草馬賽克病”（tobacco mosaic disease，漢譯為“煙草花葉病”），并認(rèn)為它是由某種病原菌引起的。圖2. （左）患病的煙草葉片；（右）Adolf Mayer（1843-1942） |來(lái)源：wikipedia

此時(shí)的微生物學(xué)正經(jīng)歷著高速發(fā)展的黃金時(shí)代。發(fā)現(xiàn)了炭疽、結(jié)核病和霍亂致病細(xì)菌的德國(guó)科學(xué)家羅伯特·科赫（Robert Koch）是這一時(shí)代的關(guān)鍵人物。他于1890完善并發(fā)表了著名的“科赫法則”（Koch’s Postulates），用于建立病原體與疾病之間的確切關(guān)系。內(nèi)容如下：

1. 所有患某病的個(gè)體中均存在某微生物，但健康個(gè)體中不存在該種微生物。

2. 必須從患病個(gè)體中分離到這種微生物，并在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行純培養(yǎng)。

3. 將實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的此微生物接種給健康個(gè)體后必須引起相同的疾病。

4. 接種后患病的個(gè)體身上必須能夠再次分離到此種微生物。

圖3.“科赫法則”（Koch’s Postulates）這一說(shuō)法是德國(guó)細(xì)菌學(xué)家F. Loeffler根據(jù)科赫的報(bào)告總結(jié)并提出的，其核心內(nèi)容是證明病原體與疾病之間因果關(guān)系的判斷標(biāo)準(zhǔn)。來(lái)源| Kaufmann S. H. E. (2021). Vaccine Development Against Tuberculosis Over the Last 140 Years: Failure as Part of Success. Frontiers in microbiology, 12, 750124.

符合上述準(zhǔn)則，即可證明這種微生物導(dǎo)致了這種疾病。運(yùn)用科赫法則，人們鑒定出了很多病原微生物。Mayer研究煙草疾病，遵循的也是這一思路。

通過(guò)一個(gè)關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)，Mayer證明了馬賽克病是具有傳染性的：將患病葉片搗碎浸泡在水中，得到綠色懸浮液體，用玻璃毛細(xì)管吸入微量的汁液并注入健康煙草植株的葉脈中，一段時(shí)間后，10株接受注射的植株有9株出現(xiàn)了相同的馬賽克狀病變。這充分說(shuō)明患病葉片搗碎制作的汁液具有傳染性。

但是，Mayer并沒(méi)有在這些汁液中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌。他想用濾紙濾除汁液中的細(xì)菌，但過(guò)濾后的汁液依然致病。當(dāng)時(shí)過(guò)濾葉片汁液的技術(shù)有限，僅僅依靠濾紙進(jìn)行粗濾。因此，他堅(jiān)持認(rèn)為，引起植物病癥的微生物是一種極小的、在顯微鏡下不可見(jiàn)的細(xì)菌，并斷言通過(guò)多次過(guò)濾能夠獲得不含該病菌的純凈汁液。

二

失之交臂

直到1884年，法國(guó)科學(xué)家巴斯德的助手張伯倫（Charles Chamberland）發(fā)明了一種陶瓷濾器，可以過(guò)濾當(dāng)時(shí)已知的最小病原體——也就是細(xì)菌，稱為張伯倫濾器（Chamberland filter）。這樣，借助這種能夠?yàn)V除細(xì)菌的濾器，人們就可以比較含有細(xì)菌的患病個(gè)體提取液和不含細(xì)菌的提取液的致病能力，從而研究細(xì)菌性傳染病和細(xì)菌毒素。

圖4.張伯倫濾器，當(dāng)時(shí)認(rèn)為可以將細(xì)菌濾除丨來(lái)源：wikipedia

1887年，俄國(guó)植物學(xué)家Dmitri Ivanovsky 在研究克里米亞的煙草花葉病時(shí)，將患病葉片的汁液通過(guò)多孔陶瓷制成的細(xì)菌過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，再將過(guò)濾后的汁液涂抹在健康的煙草葉片上，卻發(fā)現(xiàn)健康葉片同樣呈現(xiàn)出類似患病葉片的斑駁黃色。這一結(jié)果表明，這種病害的病原體可以通過(guò)細(xì)菌濾器，暗示著煙草花葉病有可能并不是人們熟知的細(xì)菌引起的。但秉持著嚴(yán)謹(jǐn)務(wù)實(shí)的精神，Iwanowski還是在1892年公開(kāi)發(fā)表的文章中提出，導(dǎo)致煙草花葉病的是某種可過(guò)濾性的細(xì)菌或其分泌的毒素。畢竟，世界上總還是有可能存在更小的細(xì)菌，小到連張伯倫濾器也濾不掉的呀！

Iwanowski的實(shí)驗(yàn)結(jié)果引起了許多科學(xué)家的興趣，一位名叫Martinus Beijerinck的荷蘭微生物學(xué)家（圖6）獨(dú)立進(jìn)行了一個(gè)幾乎與Iwanowski相同的實(shí)驗(yàn)，但他還將經(jīng)陶瓷濾器過(guò)濾后的煙葉汁液涂抹在了瓊脂上（瓊脂是一種微生物固體培養(yǎng)基配置的常用試劑，類似果凍、仙草凍成分一類的東西）。一段時(shí)間后，他發(fā)現(xiàn)這種神秘的致病物質(zhì)竟然可以擴(kuò)散進(jìn)入瓊脂。而一般來(lái)說(shuō)，細(xì)菌只能在瓊脂固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，形成菌落，極少能夠擴(kuò)散到固體培養(yǎng)基內(nèi)部。當(dāng)然，細(xì)菌毒素也可以在瓊脂中擴(kuò)散，因此，這種致病物質(zhì)要么是一種新的病原體，要么是毒素。

圖4. Iwanowski的實(shí)驗(yàn)流程，Beijerinck加入了瓊脂，病原體在瓊脂中擴(kuò)散后依然能感染葉片 | 作者作圖

同時(shí)，Beijerinck還把受感染葉片（圖中的葉片②）的汁液重新過(guò)濾后涂抹在另一株健康植物上，發(fā)現(xiàn)健康植物同樣能夠患病。這說(shuō)明，新的健康葉片是被感染了，而不是中毒（接觸毒素），因?yàn)橹挥胁≡w才會(huì)繁殖變多，源源不斷地感染新的葉片，而毒素的量是有限的，會(huì)稀釋、會(huì)消失。

綜上，這是一種神秘的生物，能夠在致病力不減弱的條件下傳播，而且好像只能在葉片中繁殖，一旦離開(kāi)了煙草葉片，它似乎也就銷聲匿跡了。1898年，Beijerinck公開(kāi)發(fā)表了他的發(fā)現(xiàn)，并將這種具有傳染性的、能夠在過(guò)濾后仍然保持活性的、類似液體的新型病原體用拉丁短語(yǔ)“contagium vivum fluidum”的縮寫(xiě)“virus”（病毒）來(lái)表示。

作為第一個(gè)提出“病毒”這一概念的科學(xué)家，Beijerinck的工作可謂是奠定了病毒學(xué)的基礎(chǔ)。盡管他錯(cuò)誤地認(rèn)為病毒是一種“毒液”（但其實(shí)是顆粒）。然而，在那個(gè)時(shí)代，他的實(shí)驗(yàn)結(jié)論看起來(lái)太過(guò)激進(jìn)，與早期細(xì)菌理論發(fā)生沖突，因此他觀點(diǎn)并沒(méi)有得到普遍認(rèn)可，甚至遭到了先前研究者Iwanowski的口誅筆伐。

“這個(gè)問(wèn)題早就下定論了?！盜wanowski如是說(shuō)。

圖5. （左）Dmitri Ivanovsky（1864-1920）；（右）Martinus Beijerinck（1851-1931） | 來(lái)源：wikipedia

三

廬山真面

很顯然，一旦某位大牛的觀點(diǎn)被充分肯定后，它的地位便很難被輕易撼動(dòng)，在當(dāng)時(shí)的微生物領(lǐng)域中，科赫提出的研究法則擁有黃金般至高無(wú)上的地位，同時(shí)也變成了套在科學(xué)家腦袋里的一個(gè)枷鎖。

實(shí)際上，這一時(shí)期在研究其他疾病的過(guò)程中，許多科學(xué)家的實(shí)驗(yàn)結(jié)論似乎都站在了Beijerinck這一邊，但由于無(wú)法使用顯微鏡直接觀察濾過(guò)性病原體，20世紀(jì)20年代發(fā)現(xiàn)的許多與濾過(guò)性病原體有關(guān)的疾病都無(wú)法得到準(zhǔn)確定論。這類疾病的病原體究竟是微小細(xì)菌、細(xì)菌分泌物還是其他物質(zhì)，這種濾過(guò)性病原體的本質(zhì)究竟是什么，始終都沒(méi)有一個(gè)靠譜的答案?！安《具€是猶抱琵琶，不愿向世人展示真正的面目。

直到1935年，Beijerinck的猜測(cè)終于被美國(guó)化學(xué)家Wendell M. Stanley證實(shí)。Stanley認(rèn)為，煙葉上的濾過(guò)性病原體可能是一種蛋白質(zhì)分子，并首先通過(guò)X射線衍射觀察到了從病葉榨汁中分離出的病毒晶體（其實(shí)最清晰的煙草花葉病毒X射線衍射圖像是由發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的Rosalind Franklin獲得的，這位女科學(xué)家簡(jiǎn)直非同小可），同時(shí)了解到這個(gè)晶體當(dāng)中還含有核酸成分，這一發(fā)現(xiàn)為他贏得了1946年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1941年，隨著電子顯微鏡的問(wèn)世，人們才終于獲得了第一張呈現(xiàn)煙草花葉病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)的照片 (圖6)，這個(gè)細(xì)瘦的棍棒狀病毒可算是露出了廬山真面目。

圖6. 電鏡下的煙草花葉病毒丨來(lái)源：wikipedia

煙草花葉病毒（TMV）是一種單鏈RNA病毒（圖7），是煙草花葉病等植物疾病的病原體，屬于Tobamovirus群。TMV病毒粒體為直桿狀，長(zhǎng)約300納米、直徑約為15納米，有一條長(zhǎng)約6400堿基的單鏈正義RNA（+ssRNA）基因組。TMV的基因組RNA這的3’末端具有tRNA樣結(jié)構(gòu)，5’末端具有甲基化核苷酸帽。

圖7. 煙草花葉病毒結(jié)構(gòu)示意圖。煙草花葉病毒是一種桿狀病毒③，一般長(zhǎng)300nm，直徑18nm，由外部的衣殼②和內(nèi)部單鏈RNA①組成。 來(lái)源| Thomas Splettstoesser (www.scistyle.com)

TMV基因組編碼4個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frames，ORF），其中的兩個(gè)ORF由于核糖體通讀導(dǎo)致只產(chǎn)生一個(gè)蛋白質(zhì)分子，這4個(gè)基因分別編碼復(fù)制酶（含有甲基轉(zhuǎn)移酶[MT]和RNA解旋酶[Hel]結(jié)構(gòu)域）、RNA依賴的RNA聚合酶、病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白（movement protein，MP）和衣殼蛋白（capsid protein ，CP）。核酸被2130個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成的衣殼所包裹，衣殼是由衣殼蛋白自組裝成形成的棒狀螺旋結(jié)構(gòu)，構(gòu)成了煙草花葉病毒的棒狀外觀。

圖8. 煙草花葉病毒(TMV)基因組結(jié)構(gòu)圖

煙草花葉病毒（TMV）專門(mén)感染植物，主要感染經(jīng)濟(jì)作物煙草，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。煙草花葉病的防治也是以煙株為主要對(duì)象，加強(qiáng)煙株保健栽培，切斷傳播途徑，突出抗性誘導(dǎo)并采取化學(xué)藥劑輔助。

但實(shí)際上，TMV的寄主范圍極為廣泛，現(xiàn)已知對(duì)單子葉植物22科中的198種植物具有侵染性。TMV有不同株系，我國(guó)主要有普通株系、番茄株系、黃斑株系和珠斑等4個(gè)株系，致病力不同，引發(fā)的癥狀不同；與其他病毒復(fù)合侵染所造成的癥狀也具有多樣性。

圖11 煙草花葉病毒除了感染煙草之外，還可以感染茄科花卉、蔬菜，以及近兩百種植物。來(lái)源|https://www.greenhousegrower.com/production/tips-for-tackling-tobacco-mosaic-virus/；https://www.apsnet.org/edcenter/disandpath/viral/pdlessons/Pages/TobaccoMosaic.aspx

TMV主要通過(guò)汁液傳播，當(dāng)葉片輕微摩擦造成微傷口時(shí)，侵入葉片細(xì)胞，在薄壁細(xì)胞內(nèi)繁殖，后進(jìn)入維管束組織傳染整株。同時(shí)，煙田中的蝗蟲(chóng)、煙青蟲(chóng)等咀嚼式口器的昆蟲(chóng)也可傳播TMV。

TMV是一種極其穩(wěn)定的病毒，有極強(qiáng)的致病力和環(huán)境抗性，在干煙葉中能存活長(zhǎng)達(dá)52年，稀釋100萬(wàn)倍后仍具有侵染活性，在干燥的葉子上，它可以持續(xù)30分鐘承受高達(dá)50℃的溫度。因此，在溫室干活兒的種植工人，如果平時(shí)吸煙的話，就有可能對(duì)溫室植物造成威脅。不過(guò)，話說(shuō)回來(lái)，也正是因?yàn)門(mén)MV的穩(wěn)定性如此之好，人們才能夠發(fā)現(xiàn)它。

四

豐碑獻(xiàn)禮

煙草花葉病毒（TMV）作為首個(gè)被人類發(fā)現(xiàn)的病毒，在病毒學(xué)研究史上具有開(kāi)創(chuàng)性的意義。與其他微生物學(xué)研究類似，研究TMV病毒的過(guò)程中，科學(xué)家也獲得了一些對(duì)生命科學(xué)發(fā)展極其重要的結(jié)論。在研究“遺傳物質(zhì)的本質(zhì)究竟是什么”的過(guò)程中，TMV告訴我們，RNA也可以做遺傳物質(zhì)。

1936年，英國(guó)洛桑農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站植物病理部門(mén)的Frederick Bawden和劍橋大學(xué)病理系的Norman Pirie合作，對(duì)用沉淀方法精制出的煙草花葉病毒結(jié)晶進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)結(jié)晶中的含氮量為16.7%、含磷量為0.5%、含糖量為2.5%。他們深入研究后指出：煙草花葉病毒大約是由95%的蛋白質(zhì)和5%的RNA組成的核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體。

Bawden和Pirie雖然證明了煙草花葉病毒中含有RNA，但是他們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)RNA作為基因組攜帶著重要的遺傳信息。Bawden的弟子B. D. Harrison曾在文章中談到，Bawden和Pirie當(dāng)時(shí)曾嘗試研究RNA是否具有傳染性，但可能是由于兩人的實(shí)驗(yàn)室相距有50英里，等Pirie把分離出的RNA運(yùn)送給Bawden時(shí)，RNA已經(jīng)失活，所以Bawden和Pirie未能發(fā)現(xiàn)RNA的傳染性，錯(cuò)失了RNA作為遺傳物質(zhì)這一重大發(fā)現(xiàn)

（敬告各位領(lǐng)導(dǎo)，請(qǐng)給科研人員創(chuàng)造工作和生活的各種便利）。

“TMV是一種蛋白質(zhì)，而RNA要么是污染物，要么起了結(jié)構(gòu)性作用”,這是當(dāng)時(shí)科學(xué)家的推斷。眾所周知，病毒可能包含DNA（例如痘病毒、腺病毒等）或RNA（例如流行性感冒病毒、冠狀病毒等）。但多年來(lái)，人們一直認(rèn)為基因組僅由DNA組成（1944年肺炎球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、1952年T2噬菌體實(shí)驗(yàn)）。煙草花葉病毒中只有RNA？顯然“出大事了”。

最終，20年后，德國(guó)科學(xué)家Alfred Gierer和Gerhard Schramm于1956年發(fā)現(xiàn)了RNA具有感染能力。他們將TMV放在水和苯酚中震蕩，使RNA與蛋白質(zhì)分離后，再用提純過(guò)的RNA去給煙草接種，結(jié)果煙草葉子上出現(xiàn)了典型的花葉病斑。而當(dāng)用核糖核酸酶對(duì)RNA進(jìn)行處理，令RNA分解，再給煙草接種，煙草葉子上并不會(huì)出現(xiàn)病斑。經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證之后，Gierer和Schramm指出，煙草花葉病毒的RNA成分在接種后的煙草葉片中能夠合成出新的煙草花葉病毒，因此，RNA是一種遺傳物質(zhì)！第二年，德國(guó)生化學(xué)家Heinz Fraenkel-Conrat和他的妻子Beatrice Singer通過(guò)病毒重建實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了Gierer和Schramm的上述結(jié)論（圖9）。

圖9. TMV病毒RNA可以產(chǎn)生新的病毒顆粒，而病毒蛋白不能。重組后的病毒顆粒再次感染后產(chǎn)生的新病毒顆粒的種類取決于重組病毒中的核酸種類。來(lái)源|https://biologyreader.com/fraenkel-conrat-experiment.html

五

弗變則悖

《呂氏春秋·覽·慎大覽》有云：“治國(guó)無(wú)法則亂，守法而弗變則悖，悖亂不可以持國(guó)?！敝卫韲?guó)家沒(méi)有一定的法制就會(huì)大亂，死守故法不知變革也會(huì)大亂?？茖W(xué)研究也是這樣一個(gè)不斷變動(dòng)的過(guò)程：要建立觀點(diǎn)去揭示真理，但更強(qiáng)調(diào)修正甚至推翻陳舊或錯(cuò)誤的觀點(diǎn)。

科赫法則在早期病原學(xué)研究中具有不可磨滅的指導(dǎo)作用，但也成為某些人的“精神枷鎖”?！癒och"s Postulates”并不是law或rule，而是四條“假設(shè)”，是判定微生物之為病原體所需要滿足的條件。實(shí)際上，許多病原體的特征并不完全符合科赫法則所要求的條件。例如，霍亂弧菌也存在于健康人體內(nèi)，這違反了原始科赫法則的第一條；HIV不能在體外獨(dú)立培養(yǎng)（需要在活細(xì)胞內(nèi)才能復(fù)制），這不滿足科赫法則的第二條。直到20世紀(jì)80年代，科赫法則的“原教旨派 ”還在用最陳舊的科赫法則版本來(lái)質(zhì)疑HIV的存在，質(zhì)疑幽門(mén)螺桿菌與胃潰瘍之間的關(guān)系。但這不能怪科赫，因?yàn)樗救撕髞?lái)發(fā)現(xiàn)了感染霍亂或傷寒的無(wú)癥狀攜帶者，從而修正了第一條法則中“健康個(gè)體中不存在該種微生物”的嚴(yán)格要求。

隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，以DNA結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)為標(biāo)志的現(xiàn)代生物技術(shù)使病原學(xué)研究的面貌發(fā)生了巨大的變化。美國(guó)微生物學(xué)家Stanley Falkow圍繞“毒力因子”致病的分子證據(jù)，提出了“分子科赫假設(shè)”（Molecular Koch’s postulates）。1996 年，David Fredricks 和 David Relman又建立了包含七條內(nèi)容的微生物與疾病因果關(guān)系的分子指南。這些理論的核心是發(fā)現(xiàn)與致病有關(guān)的病原體的分子證據(jù)。在本次新冠疫情中，“不明原因肺炎”出現(xiàn)不到兩周，科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)其病原體為新型冠狀病毒SARS-CoV-2，就是成功的“以病毒基因組序列為關(guān)鍵證據(jù)”的病原學(xué)研究實(shí)踐。

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